少年经历
顾允成，字季时，号泾凡，明嘉靖三十三年（1554年）十月二十九日生于无锡泾里（今张泾），自幼家境清贫，性情耿直刚烈。其父顾学曾任乡里亭长，经营过豆腐粮米等小作坊买卖，为人豪放，颇多见闻，因此注重顾家兄弟的教育。顾允成自幼聪敏，十四岁师从张少弦，万历元年（1573年）得补郡诸生。当时常州知府施观民创办龙城书院，顾宪成、顾允成兄弟都被选送其中，在龙城书院接受良好教育。
中第遣归
万历十四年（1586年），顾允成赴殿试，对策切中时事毫无隐讳，直接评议皇帝宠妃、立储之事。由于顾允成的言辞慷慨激烈，令阅卷官何心泉惊骇不已，想弃之不用。幸得大学士王锡爵取阅后决定录取，但仅仅置于榜末。
中进士后顾允成尚未被授予官职，此时恰遇南京督学御史房寰上疏诋毁海瑞。顾允成倍感愤慨，与彭遵古、诸寿贤联名上疏，弹劾房寰是出于对贤者的妒忌而诬蔑正直的大臣。当时房寰诬告海瑞一事，朝中官员大多切齿憎恶，但朝廷故意维护，只象征性批评房寰。 待到顾允成上书，朝廷即称房寰已被处分，顾允成等人是越级妄奏，命夺去三人冠带，遣返归家反省。并责令九卿约束办事的进士，今后不得妄言时政。当时南京太仆卿沈思孝上疏替顾允成等说情，结果也被责罚。
复起再贬
不久后，南京御史陈邦科请求录用顾允成等人，未被准许。万历十六年（1588年），南京巡按御史再次上奏推荐，顾允成得以起任南康府教授。此后历任保定府教授、国子监博士、礼部主事等职。
万历二十一年（1593年），皇帝下诏“三王并封”。顾允成与张纳陛、岳元声合疏直谏，认为绝不可行，并称：“自明朝建立以来，嫡长子被封王（而非太子）的事不曾有过，王锡爵怎能专断此事，皇上岂能（违背祖训）独创此事。”此前已有朱维京、王如坚、涂杰、王学曾等官员进谏而被贬谪，上书谏止的官员越来越多，皇帝知道不能全部惩处，只命遵旨行事。
不久后，吏部尚书孙鑨等因为再提此事而被责罚。顾允成又主持公道，上疏指责阁臣张位，还牵涉到王锡爵。张纳陛也随之附和上书。皇帝看后震怒，以忤旨罪名将顾允成贬为光州判官，张纳陛贬为邓州判官。顾允成没有领旨赴任，而是请辞归家，此后不再复出。
随兄讲学
万历二十二年（1594年），顾宪成亦遭革职还家。兄弟二人决定从事讲学活动，宣扬自己的政治主张。自万历二十二年（1594年）至万历三十一年（1603年）的十年时间里，顾允成与顾宪成一起在故里讲学。江南学人闻风趋赴，泾里客舍到处都住满前来听讲者。张泾在当时成为江南无锡地区学术思想传播的重要活动中心。
万历三十二年（1604年），顾氏兄弟决定修复无锡城内的东林书院，得到许多地方人士乃至常州知府、无锡知县的资助和支持。同年十月，顾允成与顾宪成、高攀龙、安希范、刘元珍、钱一本、薛敷教、叶茂才（东林八君子）等人发起东林大会，制定了《东林会约》，规定每年举行大会一、二次，每月小会一次。
东林书院修复后，顾允成与顾宪成常年寒暑不缀，早出晚归，为讲学奔忙。由于书院内江南远近士人云集，顾氏兄弟在主持讲会时既要与人发言讨论、酬答释疑，同时还要负责安排赴会学人的膳食寝居。当时无锡城内除东林书院外，顾家别无其他栖息之所。为便利讲学，免除奔波劳苦。顾允成于书院修复次年，出资在东林书院后购置一块宅基，建成“小辨斋”，作为他在城内的居息讲学之所。
逝世追封
万历三十五年（1607年）六月二十一日，顾允成病逝于小辨斋内，享年五十四岁。留有《小辨斋偶存》八卷（附《事定录》三卷）等著述。
明朝天启年中，顾允成与张纳陛同受朝廷追赠为光禄少卿。